Obsah
- TL; DR (príliš dlho; neprečítané)
- Pufr a soľ
- Rozpúšťadlá čistiacich prostriedkov
- Chelatačné činidlá a inhibítory
- Alkalická lýza
Lyse je slovo, ktoré pochádza z gréčtiny a znamená iba „rozštiepiť“ alebo „roztrhnúť“. Je zrejmé, že výrazy sa týkajú toho, čo sa deje s bunkami v lýzovom pufri, čo je riešenie, ktoré ich rozdeľuje, aby sa extrahoval ich obsah. Vedci používajú lyzačné tlmivé roztoky pri extrahovaní DNA alebo proteínov z buniek na analýzu, najmä v prípade baktérií. Typ tlmivého roztoku na bunkovú lýzu sa líši v závislosti od druhu experimentu, i keď niektoré z nasledujúcich možností sú nasledujúce.
TL; DR (príliš dlho; neprečítané)
Lyzačné pufre pomáhajú rozbiť otvorené bunky, takže k ich obsahu je možné získať prístup alebo ich odstrániť. Niektoré príklady zahŕňajú soli, detergenty, chelatačné činidlá a inhibítory a niektoré alkalické chemikálie.
Pufr a soľ
Pufre stabilizujú pH, zatiaľ čo sa bunky štiepia. Tris-HCL predstavuje jednu z najbežnejších chemikálií na tlmenie pri pH 8. HEPES je ďalšou bežnou tlmivou chemikáliou v týchto experimentoch. Chlorid sodný môže tiež zvýšiť iónovú silu, celkovú koncentráciu rozpustených látok mimo buniek. Tento posledný bod má určitý význam, pretože voda môže difundovať cez bunkové membrány z oblastí s nízkou koncentráciou rozpustenej látky do oblastí s vysokou koncentráciou rozpustenej látky.
Rozpúšťadlá čistiacich prostriedkov
Čistiace prostriedky rozpúšťajú bunkové membrány, takže obsah buniek môže uniknúť. Majú a amfipatickú molekulárnu štruktúru (t. J. Molekuly s jedným koncom, ktorý ľahko interaguje s molekulami vody, zatiaľ čo druhý hydrofóbny alebo "voda obávajúci" koniec nie je). Môžu rozpustiť tuky vytváraním miciel, malých zhlukov, kde hydrofóbne zvyšky molekúl detergentu smerujú dovnútra smerom k molekulám tuku. Bežné detergenty zahŕňajú dodecylsulfát sodný alebo SDS, NP-40 a tritonX.
Chelatačné činidlá a inhibítory
Lytické tlmivé roztoky typicky tiež zahŕňajú chelatačné činidlá, ako je kyselina etyléndiamíntetraoctová (EDTA) alebo kyselina etylénglykoltetraoctová (EGTA). Tieto chemikálie sa viažu na kovové ióny s dvoma pozitívnymi nábojmi (napr. Horčík a vápnik), takže ich nie sú k dispozícii pre iné reakcie. Mnoho DNAses (bielkoviny, ktoré žuvajú DNA) a proteázy (bielkoviny, ktoré krájajú iné proteíny) potrebujú na fungovanie ióny horčíka, takže ich zbavením tejto kľúčovej zložky pomáhajú EDTA a EGTA znižovať hladinu aktivity proteázy alebo DNAázy. Nevylučujú to však úplne a niektoré proteázy nezávisia od kofaktorov horčíka, takže lýzové pufre niekedy zahŕňajú aj chemikálie nazývané proteázové inhibítory, ktoré sa viažu na proteázy a bránia im v správnom fungovaní.
Alkalická lýza
Alkalická lýza, veľmi bežná technika čistenia plazmidov od baktérií, zahŕňa tri roztoky. Prvý obsahuje glukózu, tris-HCL tlmivý roztok, EDTA a RNAázy. Glukóza vytvára vysokú koncentráciu rozpustenej látky mimo baktérií, takže sa stávajú trochu ochabnutými, čo uľahčuje ich lýzu. EDTA a tris-HCL fungujú, ako už bolo opísané, zatiaľ čo RNAse bude žuť všetku RNA vo vnútri bunky, aby ju dostala von z cesty. Druhé riešenie skutočne lyzuje bunky. Tento obsahuje SDS detergent a NaOH, ktoré zvyšujú pH na 12 alebo vyššie, denaturujú proteíny vo vnútri bunky a spôsobujú, že sa DNA separuje na jednotlivé vlákna. Tretí roztok obsahuje octan draselný na obnovenie pH na neutrálnejšiu úroveň, aby sa vlákna plazmidovej DNA mohli opäť spojiť. Medzitým sa denaturované proteíny zhlukujú a zrážajú, zatiaľ čo ióny dodecylsulfátu sa spájajú s iónmi draslíka za vzniku nerozpustnej zlúčeniny, ktorá sa tiež zráža z roztoku.