Obsah
Pri elektroforéze na géli sa vzorky DNA alebo proteínov separujú - zvyčajne na základe veľkosti - použitím elektrického poľa, ktoré spôsobuje ich migráciu cez gél. Použitie gélovej elektroforézy je v biomedicínskych výskumných laboratóriách bežné a používa sa na zodpovedanie rôznych otázok, takže neexistuje skutočne univerzálny spôsob analýzy výsledkov.
Rôzne techniky ako napríklad Western blotting, Northern blotting a Southern blotting napríklad zahŕňajú gélovú elektroforézu.
Ak robíte elektroforézu vzoriek DNA na agarózovom géli, čo je najbežnejší druh postupu, budete zvyčajne musieť urobiť aspoň dve veci: 1) odlíšiť nezrezané plazmidy od inzertov, odrezaných plazmidov a rezaných plazmidov a 2) odhadnúť veľkosť rôznych Fragmenty DNA so štandardnou krivkou Excel alebo kalkulačka.
Tu je, ako to funguje.
Skontrolujte svoj laboratórny zápisník a zistite, ktoré vzorky boli vložené do ktorých pruhov. Keď ste vložili jamky do gélu, mali by ste si všimnúť identitu každej dráhy / vzorky.
Určite, ktorý pruh obsahuje „rebrík“ štandardov DNA. Sú to fragmenty známej dĺžky; ich migračná vzdialenosť sa môže použiť na určenie veľkosti fragmentov vzorky pomocou štandardnej krivky Excel alebo inej kalkulačky.
Pomocou pravítka zmerajte vzdialenosť na snímke od jamiek k sledovaciemu farbivu, ktoré prešlo ďalej ako ktorýkoľvek z pásov DNA (inými slovami, bude na spodku gélu). Zaznamenajte si toto číslo - jednotky, ktoré používate, nie sú dôležité.
Zmerajte vzdialenosť na vašom obrázku od jamiek k jednotlivým pásmam v „rebríku“ a potom ju vydeľte vzdialenosťou prejdenou sledovacím farbivom. Tento výpočet poskytuje relatívnu pohyblivosť každého pásma.
Príklad: Predpokladajme, že sledovacie farbiace pásmo prešlo 6 palcov a máme tri pruhy, ktoré prešli 5, 4,5 a 3,5 palca.
Aká je ich relatívna mobilita? Odpoveď: Rozdeľujeme 5, 4,5 a 3,5 na 6, aby sme získali relatívnu mobilitu 0,833, 0,75 a 0,5833.
Zadajte relatívne mobility do tabuľky (Excel alebo iný podobný program, ktorý používate) spolu s veľkosťou každého fragmentu v rebríku v kilobázach.
Výrobca vám poskytne veľkosť každého fragmentu v rebríkoch, ktoré dodávajú, takže by ste už mali mať tieto informácie.
Grafy s relatívnou pohyblivosťou na x a veľkosť v kilobázach na y.
Pomocou funkcie Trendline v tabuľkovom procesore prispôsobte rovnicu údajom. Táto rovnica by mala byť výkonovou rovnicou (napr. X ^ -2) a mala by zodpovedať údajom relatívne dobre (koeficient R najmenej 0,9). Týmto sa vytvorí krivka a štandardná krivka Excel.
Pozrite sa na pásy zodpovedajúce vašim vzorkám.
Pamätajte, že menšie fragmenty DNA cestujú ďalej cez gél ako veľké fragmenty DNA, takže tie, ktoré sú najbližšie k sledovaciemu farbivu, budú najmenšie. Upozorňujeme však, že ak je plazmidová (kruhová) DNA nezrezaná, stane sa „supercoiled“ alebo skrútená ako telefónna šnúra, čo v skutočnosti spôsobí jej cestovanie ďalej ako lineárna DNA rovnakej veľkosti.
Podobne aj „prezývaný“ plazmid, ktorý bol neúplne rezaný, bude cestovať a kratšie vzdialenosť ako lineárna DNA rovnakej veľkosti. Preto nemôžete odhadnúť veľkosť nezrezaných plazmidov z vášho gélu.
Prirovnajte pásma v každom jazdnom pruhu k identite vzorky, ktorú ste naložili do tohto jazdného pruhu, a určte, či to, čo vidíte, je to, čo by ste očakávali. Závisí to od povahy vášho experimentu.
Všeobecne však platí, že ak ste strávili inzertný plazmid dvoma reštrikčnými enzýmami, očakávali by ste, že sa inzert z plazmidu uvoľní.
Pretože je oveľa menšia ako plazmid, očakávali by ste, že v tomto pruhu uvidíte dva pruhy, jeden blízko horného a druhý dole spodný. Plazmidový rez iba s jedným reštrikčným enzýmom by mal tvoriť iba jeden pás, ktorý sa pohybuje trochu ďalej ako plazmidový rez s dvoma reštrikčnými enzýmami, ale nikde blízko, pokiaľ ide o inzert.
Zmerajte vzdialenosť od jamiek k rezanému plazmidu a vložte pásy pravítkom. Vydeľte tieto čísla vzdialenosťou prechádzajúcou sledovacím farbivom, aby ste našli relatívnu pohyblivosť inzertov a rezaných plazmidov.
Zapojte relatívnu mobilitu inzertov a odrežte plazmidy do rovnice, ktorú pre vás tabuľkový program vypočítal. Tento výpočet by mal poskytnúť odhad veľkosti týchto plazmidov.