Obsah
DNA
Kyselina deoxyribonukleová a proteíny. DNA je usporiadaná do jednotiek nazývaných gény, z ktorých každá kóduje konkrétnu RNA alebo proteínovú sekvenciu. Gény sa študujú, aby sa dozvedeli o biologickej štruktúre a funkcii, evolúcii, chorobe a mnohých ďalších aspektoch živých systémov. Aby bolo možné podrobne študovať gény, musí byť DNA izolovaná a purifikovaná z požadovaných buniek.
Extrakcia DNA
Hoci DNA z jednej bunky sa dá extrahovať a študovať, nestačí ju vidieť voľným okom. Ak chcete získať množstvo dostatočné na zaraďovanie ciev, tým viac buniek musíte pracovať s tým lepším (veľa miliónov).
Presné protokoly sa značne líšia, aby sa zohľadnili jedinečné vlastnosti konkrétnych vzoriek, ale všeobecnými krokmi sú homogenizácia, lýza, digescia, separácia a zber. Tento postup sa najlepšie vykonáva v malej (v závislosti od veľkosti vzorky) sklenenej alebo plastovej skúmavke.
Vzorka sa zvyčajne mieša alebo rozomelie na dôkladné oddelenie buniek od seba. Tým sú bunkové zložky prístupnejšie pre reagenty, ktoré nasledujú. K homogenátu sa potom pridá detergent alebo enzýmy na lýzu bunkových membrán (a jadrových membrán, ak sú bunky eukaryotické), aby sa uvoľnila DNA. V tomto okamihu je DNA obklopená proteínmi, lipidmi, uhľohydrátmi - všetko ostatné, čo bolo obsiahnuté v bunkách.
Na štiepenie proteínov môže byť potrebné ďalšie enzymatické štiepenie, aby sa neviazali na DNA a nenarúšali jeho zhromažďovanie. DNA sa oddelí od zvyšku obsahu buniek pridaním studeného, čistého, etylalkoholu alebo izopropylalkoholu. DNA nie je rozpustná v týchto alkoholoch, takže kondenzuje pri pokuse minimalizovať svoj kontakt s alkoholom. Kondenzovaná DNA sa potom zhromaždila, zvyčajne odstredením --- alebo navíjaním.
Spoolovanie DNA
Zhromažďovanie DNA spoolovaním je účinné, keď sa z extrakčného postupu získa veľké množstvo DNA. Je to tiež vynikajúca demonštračná metóda, pretože je zreteľne viditeľná pôsobivá spleť čistej DNA.
Aby bolo možné cievku DNA uložiť, musí sa separačný krok starostlivo vykonať. Pokiaľ nejde o predtým pridanú lýznu reakčnú zmes, musí sa pred pridaním alkoholu do roztoku pridať koncentrovaný soľný roztok (chlorid sodný). Studený alkohol sa pomaly naleje po strane skúmavky, aby sa vytvorila vrstva na vrchu vodného roztoku, aby sa zabránilo miešaniu. Ak sa to urobí správne, alkohol vytvorí svoju vlastnú vrstvu na hornej strane slanej vrstvy. Potom prichádza cievka.
Na odber DNA zo slanej vrstvy opatrne umiestnite sklenenú miešaciu tyčinku cez vrstvu alkoholu, kým sa nedotkne spodnej časti skúmavky. Pomaly otáčajte tyč medzi prstami a sledujte rozhranie medzi dvoma vrstvami. Ak je prítomných dostatok DNA, zhlukuje sa spolu na rozhraní medzi vrstvami, aby sa vytvorila mliečna priesvitná hmota. Roztočte tyč, aby sa okolo nej obalila DNA (to je cievka) a vytiahnite ju z trubice. DNA sa môže preniesť do inej skúmavky čistého alkoholu na uskladnenie alebo ďalšiu analýzu.