Obsah
Polymerázová reťazová reakcia alebo PCR je technika, ktorá kopíruje jeden fragment DNA na mnoho fragmentov - exponenciálne veľa. Prvým krokom v PCR je zahriatie DNA tak, aby denaturovala alebo sa roztavila na jednotlivé vlákna. Štruktúra DNA je ako lanový rebrík, v ktorom sú priečne laná s magnetickými koncami. Magnety sa spájajú a vytvárajú priečky, ktoré sa nazývajú páry párov báz, a preto odolávajú roztrhnutiu. Každý fragment DNA sa topí do jednotlivých vlákien pri rôznych teplotách. Pochopenie toho, ako je štruktúra DNA držaná pohromade jednotlivými časťami DNA, poskytne prehľad o tom, prečo sa rôzne fragmenty DNA topia pri rôznych teplotách a prečo sú také vysoké teploty potrebné.
Teplota! Teplota!
Prvým krokom PCR je roztavenie DNA tak, že sa dvojvláknová DNA separuje na jednovláknovú DNA. V prípade cicavčej DNA tento prvý krok zvyčajne zahŕňa teplo približne 95 stupňov Celzia (približne 200 Fahrenheita). Pri tejto teplote sa vodíkové väzby medzi pármi báz A-T a G-C alebo priečkami v rebríku DNA rozpadnú a rozopnú dvojvláknovú DNA. Teplota však nie je natoľko horúca, aby sa rozbila kostra fosfátového cukru, ktorá tvorí jednotlivé vlákna alebo póly rebríka. Kompletná separácia jednotlivých vlákien ich pripravuje na druhý krok PCR, čo je ochladenie, aby sa umožnilo krátkym fragmentom DNA, nazývaným priméry, viazať sa na jednotlivé vlákna.
Magnetické zipsy
Jedným z dôvodov, prečo je DNA zahrievaná na vysokú teplotu 95 stupňov Celzia, je to, že čím dlhší je dvojvláknový reťazec DNA, tým viac chce zostať spolu. Dĺžka DNA je jedným z faktorov, ktorý ovplyvňuje teplotu topenia zvolenú pre PCR na tomto kúsku DNA. A-T a G-C páry párov v dvojvláknovej DNA väzbe spolu držia dvojreťazcovú štruktúru pohromade. Čím viac po sebe idúcich párov báz medzi dvoma jednovláknovými vláknami sa spojilo, tým viac sa chcú spojiť aj ich susedia a čím silnejšia je príťažlivosť medzi týmito dvoma vláknami. Je to ako zips vyrobený z malých magnetov. Keď zavriete zips, magnety sa budú prirodzene chcieť zapnúť na zips a zostať na zips.
Silnejšie magnety pevnejšie držia
Ďalším faktorom, ktorý ovplyvňuje teplotu topenia, ktorá sa má zvoliť pre požadovaný fragment DNA, je množstvo párov báz G-C prítomných v tomto fragmente. Každý pár báz je ako dva atraktívne mini-magnety. Pár vyrobený z G a C je oveľa silnejšie priťahovaný ako pár A a T. Kus DNA, ktorý má viac párov G-C ako iný fragment, bude teda pred roztavením na jednotlivé vlákna vyžadovať vyššiu teplotu. DNA prirodzene absorbuje ultrafialové svetlo - presnejšie na vlnovej dĺžke 260 nanometrov - a jednovláknová DNA absorbuje viac svetla ako dvojreťazcová DNA. Takže meranie množstva absorbovaného svetla je spôsob merania toho, ako sa vaša dvojvláknová DNA roztavila na jednotlivé vlákna. Účinok dvojíc báz G-C a A-T na „magnetický zips“ spôsobuje to, že graf absorpcie svetla dvojvláknovej DNA vynesený proti zvýšeniu teploty je sigmoidálny, má tvar ako S a nie priamka. Krivka S predstavuje odpor tímovej práce, ktorý páry párov báz pôsobia proti teplu, pretože sa nechcú separovať.
Half-Point
Teplota, pri ktorej sa dĺžka DNA taví na jednotlivé vlákna, sa nazýva jej teplota topenia, ktorá sa označuje skratkou „Tm“. To znamená teplotu, pri ktorej sa polovica DNA v roztoku roztopila na jednotlivé vlákna a druhá polovica je stále v dvojreťazcovej forme. Teplota topenia sa líši pre každý fragment DNA. Cicavčia DNA má obsah G-C 40%, čo znamená, že zvyšných 60% párov báz sú As a Ts. Jeho obsah 40% G-C spôsobuje, že sa cicavčia DNA topí pri 87 stupňov Celzia (asi 189 Fahrenheita). Preto je prvým krokom PCR na cicavčej DNA zahrievanie na 94 stupňov Celzia (201 Fahrenheita). Iba sedem stupňov teplejšia ako teplota topenia a všetky dvojité vlákna sa úplne roztavia na jednotlivé vlákna.