Obsah
Výpočet titra vírusu je zložitý spôsob, ako povedať, že vedec počíta počet vírusov v konkrétnej vzorke. Na výpočet titrov vírusov vedci infikujú doštičky rastúcich baktérií vírusovými roztokmi v rôznych koncentráciách a zisťujú počet vírusov v pôvodnom roztoku spočítaním baktérií, ktoré odumreli v dôsledku vírusovej infekcie.
Sériové riedenia
Nasaďte si rukavice, naplňte 10 kultivačných skúmaviek 9 ml vývaru a označte ich „10 ^ -1“, „10 ^ -2“, „10 ^ -3“ a tak ďalej, až na „10 ^ -10“. Tieto skúmavky sa použije na vírusové sériové riedenia použité na výpočet titra fágu. Keďže vírusy môžu rásť do neuveriteľne vysokých koncentrácií, musíte ich zriediť, aby ste ich mohli efektívne spočítať. Každá skúmavka predstavuje desaťnásobné riedenie vírusu.
Vezmite 1 ml vírusovej kultúry, pre ktorú chcete vypočítať titer fágu a pomocou pipety ju preneste do skúmavky s názvom „10 ^ -1“. Skúmavku dobre premiešajte. Toto je vaše prvé desaťnásobné riedenie.
Vezmite 1 ml zmiešanej kultúry z vašej skúmavky označenej „10 ^ -1“ a preneste ju novou pipetou do nasledujúcej skúmavky označenej „10 ^ -2“. Túto skúmavku tiež premiešajte.
Pokračujte v tomto postupe a vytvorte sériu sériových riedení. Skončíte s 9 skúmavkami s objemom 9 ml a 1 skúmavkou s objemom 10 ml. Vírusová záťaž vo vašich skúmavkách sa zriedi kdekoľvek od 10-krát (vaša prvá skúmavka) alebo 100-krát (vaša druhá skúmavka) do desať miliárd krát (vaša posledná skúmavka).
Príprava platní na výpočet titra
Vezmite 10 skúmaviek z mäkkého agaru s tryptónom a 10 platničiek Petri a označte ich, aby zodpovedali vašim skúmavkám so sériovým riedením.
Uvoľnite čiapky tak, aby sa nevyskakovali do tepla a potom vložte skúmavky s agarom do kadičky s vriacou vodou. Roztaví sa agar, aby ste ho mohli naliať do Petriho doštičky.
Skúmavky preneste do horúcovodného kúpeľa nastaveného na minimálne 45 stupňov Celzia. Toto zabezpečí, že váš agar v skúmavkách neztuhne skôr, ako ho budete mať možnosť naliať do Petriho misky.
Pridajte do svojho agaru dve kvapky bakteriálnej kultúry a jemne premiešajte. Jedná sa o baktérie, ktoré budú usmrtené, čo vám umožní spočítať počet vírusových častíc v konkrétnom roztoku.
Pridajte 1 ml každého sériového riedenia do zodpovedajúcej skúmavky s agarom, kým sú skúmavky stále v horúcom vodnom kúpeli. Napríklad 1 ml vášho 10 ^ -1 sériového riedenia by malo ísť do agarovej skúmavky označenej „10 ^ -1“.
Každú skúmavku premiešajte a každú skúmavku nalejte do Petriho misky so zodpovedajúcim štítkom. Tým sa vytvorí tenká vrstva agaru, ktorý bol naočkovaný baktériami a vírusmi v každej doštičke. Doštičky sa nechajú rásť cez noc v inkubátore.
Počítanie a výpočet titra vírusu
Vyberte doštičky z inkubátora a skontrolujte ich. Mali by ste vidieť zakalené oblasti v celej doštičke, kde baktérie rástli, s výnimkou malých čistých miest nazývaných plaky. Tieto plaky sú škvrnami odumretých baktérií a každý plak predstavuje jeden vírus.
Nájdite doštičku, ktorá má medzi 30 a 300 plakmi a spočítajte presný počet plakov na tejto doštičke.
Vezmite si na tabuľku počet plakov a vynásobte ich 10. Ak ste spočítali 157 plakov, dostali by ste 1570.
Vynásobte číslo, ktoré ste dostali v predchádzajúcom kroku, inverzným číslom na riediacej skúmavke. Napríklad, ak bola doska, ktorú ste vybrali, doska 10 ^ -5, vynásobili by ste 1570 x 10 ^ 5, aby ste získali 157000000. Toto konečné číslo je váš titer fágu a predstavuje počet vírusov na ml vašej pôvodnej kultúry.