Obsah
Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) je laboratórna technika používaná na separáciu a identifikáciu zlúčenín. Je to typ stĺpcovej chromatografie, ktorý sa oddeľuje od rôznych polarit zlúčenín v roztoku. HPLC sa líši od štandardnej stĺpcovej chromatografie, pretože používa tlak na rýchlejšie pretlačenie roztoku cez kolónu, a preto poskytuje rýchlejšie a niekedy presnejšie výsledky. Cieľom je oddeliť zlúčeniny v stĺpci a nechať ich vystupovať osobitne.
Coelution
V dôsledku rýchlosti HPLC a spoliehania sa na rôzne polarity zlúčenín môžu dve zlúčeniny s podobnou štruktúrou a polaritami opustiť chromatografický prístroj súčasne alebo takmer súčasne. Toto sa nazýva koelúcia. Koelúcia spôsobuje presné určenie toho, ktorá časť zmesi sa eluuje v akom okamihu.
Adsorbované zlúčeniny
HPLC typicky používa sklenenú kolónu naplnenú guľôčkami vyrobenými z rôznych materiálov. Zmesi, ktoré sú tlačené cez kolónu, obsahujú chemikálie, ktoré sa viažu s rôznymi silami na guľôčky. Sila väzby, ktorá závisí od podobnosti polarity, určuje, ako dlho sa bude chemická látka viazať na guľôčku pred jej uvoľnením. Niektoré zlúčeniny sa viažu tak silno, že sa v podstate nikdy neuvoľňujú z guľôčok v kolóne a nikdy sa nemerajú v roztoku opúšťajúcom kolónu.
náklady
Typické laboratórne separačné techniky zahŕňajú vývoj testu alebo metódy separácie a potom implementáciu tohto testu na oddelenie jednotlivých zlúčenín od roztoku. Zvyčajne to však vedie k viacerým riešeniam, ktoré tiež musia podstúpiť procedúry, čo vedie k exponenciálnemu zvýšeniu komplexnosti. Aj keď HPLC môže tento proces často zjednodušiť a zrýchliť, náklady na vývoj HPLC prístroja môžu byť obrovské. Vývoj HPLC prístroja, hoci je oveľa účinnejší, je oveľa nákladnejší ako vývoj iných testov na separáciu zlúčenín. Vďaka tomu nie je finančne životaschopná pre mnoho malých súkromných laboratórií.
zložitosť
HPLC sa používa nielen na oddelenie jednoduchých zlúčenín, ale tiež na izoláciu špecifických proteínov z bunkovej zmesi. V tomto prípade sú guľôčky v kolóne zvyčajne potiahnuté protilátkou špecifickou pre proteín, ktorý potrebujete zhromaždiť. Proteíny sa viažu na protilátky a zostávajúci roztok prechádza kolónou, potom sa proteíny uvoľnia pomocou iného roztoku a zhromaždia sa. Vyžaduje si to vysoko kvalifikovaného technika, aby stĺpec neustále monitoroval a ubezpečil sa, že proces prebieha presne podľa plánu.