Obsah
Gramovo farbenie je postup diferenciálneho farbenia, ktorý ukazuje, ktoré baktérie sú grampozitívne alebo gramnegatívne na základe farby zafarbenia. Acetónalkohol je jedno činidlo použité v tomto procese na zabezpečenie farebnej diferenciácie. Gram-pozitívne baktérie majú silnú peptidoglykánovú vrstvu a sfarbujú sa fialovo, zatiaľ čo gram-negatívne mikroorganizmy majú malú až žiadnu peptidoglykánovú vrstvu a sfarbujú sa ružovo.
Primárna fialová krištáľová fialová
Keď sa pripraví podložné sklíčko z bakteriálnej vzorky, použije sa na zafarbenie vzorky najskôr kryštalická fialová. V tomto okamihu sa Gram-pozitívne aj Gram-negatívne baktérie javia fialové. Krištáľová violeť sa zvyčajne aplikuje na sklíčko počas 30 sekúnd a potom sa prebytočné škvrny vymyjú vodou. Kryštálová violeť sa môže trochu prilepiť k peptidoglykánovým vrstvám, takže nie všetky primárne zafarbenia sa umyjú vodou.
Moridlo-Jód
K vzorke sa potom na jednu minútu pridá jód. Pôsobí ako moridlo, ktoré slúži na fixáciu farbív v procese farbenia. Jód vykonáva túto funkciu väzbou na kryštalickú fialovú a vytvára nerozpustný komplex, ktorý adheruje omnoho lepšie na hrubú peptidoglykánovú vrstvu nachádzajúcu sa v grampozitívnych bakteriálnych bunkách, ako len na samotnú kryštalickú fialovú. Po pridaní jódu nedochádza k premývaciemu kroku s vodou.
Decolorizer-Alkohol
Ako odfarbovacie činidlo sa môže použiť acetón alebo etylalkohol. Alkohol rozpúšťa lipidy nachádzajúce sa vo vonkajšej bunkovej membráne gramnegatívnych baktérií, čo umožňuje kryštálovému violet-jódovému komplexu presakovať z tenšej peptidoglykánovej vrstvy. Alkohol sa pridáva počas 10 až 20 sekúnd; naleje sa na sklíčko, kým sa všetok jód nevymyje a odtok nie je bezfarebný. V tomto okamihu procesu Gramovho farbenia sú gramnegatívne baktérie bezfarebné, zatiaľ čo grampozitívne baktérie si stále zachovávajú kryštálovú fialovú. Po dokončení je potrebné sklíčko opláchnuť vodou, aby sa zastavil odfarbovací efekt.
Counterstain-Safraninový
Safranín sa potom pridá na zvýšenie viditeľnosti a kontrastu k bezfarebným gramnegatívnym baktériám. Zafarbenie spôsobuje, že sa tieto baktérie pod mikroskopom javia ružovo. Pretože sa škvrna pridáva do celej vzorky, zafarbí aj grampozitívne baktérie, ale tmavšia krištáľovo fialová zakrýva svetlejšiu safranínovú ružovú farbu. Keď bola vzorka sklíčka zaplavená safranínom asi minútu, na premytie prebytočného škvŕn, ktoré nepriľnuli k bakteriálnym bunkám, sa použije voda.