Obsah
Spektrofotometria je neoceniteľným nástrojom v chémii a biológii. Základná myšlienka je jednoduchá: rôzne látky absorbujú svetlo / elektromagnetické žiarenie lepšie pri niektorých vlnových dĺžkach ako pri iných. Preto sú niektoré materiály priehľadné, zatiaľ čo iné sú zafarbené. Ak žiarením danej vlnovej dĺžky svietite cez roztok, čím vyššia je jeho koncentrácia, tým viac svetla absorbuje. Na výpočet koncentrácie je potrebné porovnať hodnoty a hodnoty pre štandardy známej koncentrácie. Nižšie uvedený postup je pomerne všeobecný postup, ktorý je napísaný s ohľadom na učebné laboratórium chémie, ale je možné ho upraviť aj pre iné prostredie.
Ako vždy pri práci v laboratóriu, noste si okuliare, rukavice a kabát s dlhými rukávmi, aby ste zaistili svoju vlastnú bezpečnosť.
Stlačte gumovú žiarovku, aby sa vyprázdnila vzduch, potom ju umiestnite na vrchol svojej pipety a nechajte ju uvoľniť, aby nasala vodu do pipety. Potom vyberte žiarovku a prstom zakryte hornú časť pipety; tým dôjde k utesneniu pipety tak, aby roztok vo vnútri neprúdil dovtedy, kým nebude odstránený váš prst. Jemne nadvihnite okraj svojho prsta, aby z pipety vytieklo trochu roztoku, až kým nedosiahnete požadovaný objem. Cvičte s trochou vody a kadičky, aby ste získali pocit, ako funguje odmerná pipeta. Odkaz v časti Zdroje obsahuje filmový klip, ktorý vám ukáže, ako používať pipetu v prípade, že ste nikdy predtým s jedným nepracovali.
Označte 5 skúmaviek ako štandardy 1-5. Môžete ich označiť maskovacou páskou a perom alebo pomocou suchého vymazania.
Vyberte päť koncentrácií pre svoje štandardy. Chcete, aby boli štandardné koncentrácie navzájom od seba oddelené približne rovnakým intervalom - napr. 0,1 mol, 0,2 mol, 0,3 mol, atď. - a približne v rovnakom rozmedzí, ako by ste očakávali. V súčasnosti použite nasledujúcich päť koncentrácií, nezabudnite však, že pri vykonávaní vlastného experimentu ich budete musieť upraviť:
Štandard 1: 0,1 molárny štandard 2: 0,2 molárny štandard 3: 0,3 molárny štandard 4: 0,4 molárny štandard 5: 0,5 molárny
Potom odoberte 1 molárny štandardný roztok a do skúmaviek 1-5 pridajte nasledujúce množstvá. Nezabúdajte, že tieto množstvá sa vypočítavajú pomocou koncentrácií uvedených vyššie, takže ich možno budete musieť pri vykonávaní vlastného experimentu podľa potreby upraviť.
Štandard 1: 0,8 mililitrov Štandard 2: 1,6 mililitrov Štandard 3: 2,4 mililitrov Štandard 4: 3,2 mililitrov Štandard 5: 4 mililitrov
Opláchnite odmernú pipetu a potom preneste nasledujúce množstvá deionizovanej vody:
Štandard 1: 7,2 mililitrov Štandard 2: 6,4 mililitrov Štandard 3: 5,6 mililitrov Štandard 4: 4,8 mililitrov Štandard 5: 4,0 mililitrov
V zásade ide o to, aby sa množstvo roztoku v každej skúmavke doplnilo na 8 mililitrov.
Zakryte každú zo štandardných skúmaviek parafilmom a obráťte ich, aby sa zmiešali.
Ďalších päť skúmaviek označte ako „Neznáme 1-5“. Do každého z nich pridajte rovnaké množstvo neznámeho alebo testovaného roztoku, aké ste použili s 1 molárnym roztokom pre štandardy. Inými slovami, neznámy 1 bude obsahovať 0,8 mililitra testovaného roztoku a 7,2 mililitra vody, neznámy 2 bude obsahovať 1,6 mililitra testovaného roztoku a 6,4 mililitra vody, atď.
Uzavrite každú neznámu parafilmom a opatrne premiešajte.
Zapnite spektrofotometer a nechajte ho zohriať sa. Potrebný čas bude závisieť od modelu a výrobcu.
Nastavte vlnovú dĺžku na spektrofotometri. Vlnová dĺžka bude závisieť od typu chemikálie vo vašom experimente. Pre túto chvíľu predpokladajme 500 nm, hoci nezabudnite, že budete musieť túto zmenu zmeniť pre rôzne experimenty.
Kalibrujte svoj spektrofotometer. Postup kalibrácie sa bude líšiť v závislosti od používaného zariadenia. Pri stroji Spectronic 20, bežnom modeli vo výučbových laboratóriách, najskôr nastavíte stroj tak, aby pri nezaťaženej kyvete čítalo „0 percent T“, potom ju upravte tak, aby čítala „100% T“, keď je prázdna kyveta obsahujúca deionizované naplní sa iba voda. Tieto postupy sa môžu líšiť v závislosti od typu používaného zariadenia, preto si podrobnosti pozrite v pokynoch výrobcov.
Po kalibrovaní stroja odoberte štandardnú skúmavku 1 a obsah nalejte do čistej kyvety, kým nedosiahne plniacu čiaru. Kyvetu utrite kimetrovou utierkou, aby ste odstránili všetky prsty alebo iné nečistoty. Vložte kyvetu do spektrofotometra a zaznamenajte údaj „% T“.
Tento postup opakujte pre všetkých 10 vzoriek. UISTITE SA, aby ste kyvetu medzi vzorkami vyčistili, aby ste sa uistili, že vaše výsledky sú čo najpresnejšie.
Vezmite výsledky svojich štandardov a zadajte ich do tabuľkového / grafického programu, ako je Excel alebo OpenOffice.
Pomocou tabuľkového programu vydelte 100% každou z hodnôt „% T“ pre štandardy a potom zaznamenajte výsledok. Tento výpočet vám poskytne absorbanciu. Ak zadáte vzorec, tabuľkový procesor vykoná výpočet za vás.
Príklad: Ak je% T 50,6, vzorec, ktorý zadáte do tabuľkového procesora, bude nasledujúci:
log (100/50,6)
Tabuľkový program vykoná aritmetiku.
To isté urobte pre všetkých päť neznámych / experimentálnych hodnôt.
Zaznamenajte hodnoty absorbancie pre všetkých päť štandardov s koncentráciou na osi x a absorbanciou na osi y. Pomocou tabuľky vytvorte do tohto grafu lineárnu rovnicu. Rovnica bude mať tvar y = mx + b. Väčšina tabuľkových programov bude mať funkciu lineárnej regresie. Podrobnosti o tom, ako používať funkciu lineárnej regresie, nájdete v používateľskej príručke k tabuľkovému programu.
Vezmite rovnicu pre najlepšiu líniu z vášho tabuľkového procesora a vyriešte ju pre y odčítaním b od obidvoch strán a delením obidvoch strán m. Výsledok bude vyzerať takto:
(y - b) / m = x
kde b a m sú hodnoty, ktoré zistil váš tabuľkový procesor.
Skontrolujte hodnoty absorbancie neznámych a vyberte tri, ktoré spadajú približne do rovnakého rozsahu ako štandardy. Použite tieto tri hodnoty absorbancie pre zostávajúce výpočty. Ak všetkých päť spadá do rovnakého rozsahu ako normy, môžete namiesto nich použiť všetkých päť, musíte však použiť najmenej tri.
Pripojte každú z troch hodnôt absorbancie do svojej rovnice namiesto y. Pamätajte, že vaša rovnica bola v tejto podobe:
(y - b) / m = x
Takže budete chcieť vložiť hodnotu absorbancie pre každú neznámu do rovnice namiesto y, potom vypočítať x. Na vykonanie tohto výpočtu za vás a na jeho zrýchlenie môžete použiť tabuľkový procesor. Teraz ste vypočítali koncentráciu príslušnej chemikálie v troch zriedených neznámych. Pôvodný roztok sa zriedil, aby sa pripravili tieto neznáme látky, takže teraz musíte pracovať späť a vypočítať koncentráciu pôvodného roztoku na základe zrieďovacieho faktora.
Každá neznáma vzorka, ktorú ste vložili do spektrofotometra, sa zriedila iným množstvom. Preto by ste teraz mali rozdeliť vypočítanú koncentráciu na základe absorbancie pre každú neznámu hodnotu takto:
Neznáme 1: delí sa 0,1 Neznáme 2: delí sa 0,2 Neznáme 3: delí sa 0,3 Neznáme 4: delí sa 0,4 Neznáme 5: delí sa 0,5
Nezabudnite však, že tieto čísla sú založené na predpoklade, že používate vyššie uvedené riedenia. Nezabudnite tieto hodnoty zmeniť, ak ste vzorky zriedili iným množstvom.
Pridajte svoje výsledky spolu a vydelte ich počtom výsledkov. Získate priemer. Toto číslo uveďte ako svoje zistenie koncentrácie pôvodného riešenia.