Obsah
Western blotting je jedným z najbežnejších postupov v biochemických laboratóriách. V zásade separuje proteíny od vzorky podľa veľkosti a potom testuje pomocou protilátok, aby sa stanovilo, či je daný proteín prítomný. Je užitočný nielen vo výskume, ale aj v lekárskych alebo diagnostických laboratóriách; testy na HIV aj na lymskú chorobu zahŕňajú napríklad test na imunosorbentové testy spojené s enzýmami (ELISA), po ktorom nasleduje test Western blot, ak je test ELISA pozitívny. Napriek svojej popularite má však Western blot niekoľko nevýhod.
Nonquantitative
Klasické westernové prenosy nie sú kvantitatívne. Inými slovami, hoci môžu výskumníkom povedať, či je konkrétny proteín prítomný, neumožňujú kvantifikovať, koľko proteínu je prítomné. Niektoré biotechnologické spoločnosti v súčasnosti predávajú súpravy, ktoré umožňujú vedcom alebo laboratórnym technikom kvantifikovať množstvo prítomného proteínu pomocou štandardnej krivky - funguje to však iba vtedy, ak sú k dispozícii čisté vzorky toho istého proteínu. Okrem toho je možné molekulovú hmotnosť proteínu odhadnúť iba pomocou metódy Western blot, a nie presne ako pri hmotnostnej spektrometrii.
protilátky
Western blot sa môže uskutočniť iba vtedy, ak sú k dispozícii primárne protilátky proti požadovanému proteínu. Zatiaľ čo protilátky pre mnoho rôznych proteínov sú dostupné od biotechnologických spoločností, nie sú lacné; ak primárne protilátky nie sú pre daný proteín k dispozícii, nebude možné vykonať Western blot, ktorý by hľadal konkrétny proteín. Vedci môžu navyše chcieť určiť, či bol proteín nejakým spôsobom modifikovaný - napríklad, ak bol fosforylovaný (ak k nemu bola pripojená fosfátová skupina) - as technikou Western blot potrebujú protilátky špecifické pre modifikovaný modifikovaný proteín. proteín.
výcvik
Môže byť náročné správne vykonávať westernový prenos a dosiahnuť dobré výsledky, takže personál musí byť dobre vyškolený.V tomto, ako aj vo všetkom inom, je možno najlepším tútorom skúsenosť; aj pre skúseného technika je však westernový prenos časovo náročný. Napríklad časť experimentu s gélovou elektroforézou trvá zvyčajne jednu až dve hodiny. I keď je gél v chode, môžu byť samozrejme vykonávané aj ďalšie úlohy, ale na dosiahnutie výsledkov experimentu ešte stále trvá dosť času.
Ďalšie obmedzenia
Protilátky môžu niekedy vykazovať určité mimobielzové viazanie, čo môže viesť k horším výsledkom. Pri Western blote navyše používate protilátku proti špecifickému proteínu, takže vaše výsledky vám povedia, iba ak bol tento proteín prítomný. Naopak, hmotnostná spektrometria s vysokým rozlíšením odhaľuje všetky proteíny prítomné vo vzorke a na rozdiel od klasického westernového prenosu je kvantitatívna. Je dôležité si uvedomiť, že hmotnostná spektrometria je v porovnaní s westernovým prenosom omnoho nákladnejšia a technicky náročnejšia.