Obsah
Genetická modrá bunky je kódovaná vo svojom genetickom materiáli alebo DNA. Pretože DNA nikdy neopúšťa jadro bunky, aby sa táto informácia dostala do cytoplazmy, kde sa nachádzajú iné proteíny a biochemické zložky, je potrebné najprv transkribovať DNA do messengerovej RNA (mRNA alebo poly (A) RNA). Táto mRNA sa potom premení na proteíny, ktoré vykonávajú mnoho funkcií bunky. Aby sa detegovali alebo kvantifikovali veľmi zriedkavé mRNA, pripravili sa sondy pre mikročipy alebo skonštruovali knižnice komplementárnych molekúl DNA, musí sa izolovať mRNA. Extrakcia celkovej RNA (t. J. Všetka RNA v bunke) a následná izolácia mRNA však nie sú vzájomne vylučujúce procesy; prvá sa musí vykonať, aby sa extrahovala mRNA.
Izolácia mRNA z celkovej RNA
Homogenizácia TRIzolu: Celková RNA zahŕňa všetky mRNA, prenosovú RNA, ribozomálnu RNA a ďalšie nekódujúce RNA. Na ich oddelenie od ostatných bunkových komponentov je bunka najskôr roztrhnutá, aby sa uvoľnil jej obsah. To sa deje resuspendovaním buniek peletovaných odstredením (rotácia pri vysokých rýchlostiach) v TRIzol Reagent (Life Technologies). Podobne fungujú aj iné verzie TRIzolu (ako je TRI Reagent Ambion).
Celková izolácia RNA: Na oddelenie rôznych zložiek (proteínov, DNA, RNA) bunky do vrstiev alebo fáz v suspenzii sa používa rad centrifugácií. Vrchná žltá fáza je zložená z tuku a môže sa zlikvidovať. Požadovaná fáza je sfarbená na červeno, obsahuje celkovú RNA a je zachovaná. Po extrakcii fenol-chloroformom a sérii premývaní alkoholom s použitím izopropanolu a etanolu sa môže RNA peletovať na izoláciu mRNA. Pridajte inhibítory RNázy, aby sa zabránilo tomuto enzýmu degradovať celkovú RNA.
Extrakcia mRNA: Bežne sa používa súprava na izoláciu mRNA, pretože domáce laboratórne protokoly negenerujú veľké množstvá vysoko purifikovaných mRNA. Komerčné súpravy zahŕňajú izolačnú súpravu FastTrack 2.0 od spoločnosti Invitrogen alebo Poly (A) Pure mRNA Isolation Kit. Tieto základné kroky sú spoločné pre tieto súpravy:
a) Zmiešajte lýzový pufor inhibovaný RNázou poskytnutý v súprave s až 300 mikrolitrov celkovej RNA.
b) Zahrievajte 5 minút na 65 stupňov Celzia a potom okamžite ochlaďte vzorku na ľade jednu minútu.
c) Zmiešajte ho s 0,5M chloridom sodným a potom v tejto vzorke úplne rozpustite Oligo dT (oligodeoxytymididylová kyselina).
d) Táto vzorka sa odstredí a získa sa supernatant, ktorý sa niekoľkokrát premyje v sérii väzbových a slaných tlmivých roztokov poskytnutých v súpravách.
e) Elúcia mRNA niekoľkokrát, až kým sa nedosiahne objem špecifikovaný v súprave (napr. 500 mikrolitrov).
f) Eluát sa vyzráža zrážaním octanom sodným a etanolom. Znovu suspendujte až do 20 mikrolitrov vody ošetrenej dietylpyrokarbonátom (DEPC).
g) Skladujte pri teplote -80 ° C a spektrofotometricky skontrolujte kvalitu a kvantitu.