Obsah
Pri práci s vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) je nevyhnutná dobrá kalibrácia, aby sa zabezpečili spoľahlivé a kvalitné výsledky. Správna kalibrácia prístroja HPLC sa začína vytvorením vhodného kalibračného štandardu. Vo väčšine prípadov kalibrácia v skutočnosti vyžaduje sériu štandardov zvyšujúcich sa koncentrácií, aby sa vytvorila takzvaná kalibračná krivka. Toto je vynesená čiara a súvisiaca rovnica, ktorá opisuje vzťah medzi koncentráciou testovanej chemikálie a odozvou detektora HPLC.
Určite chemikáliu, ktorú chcete testovať pomocou HPLC (ďalej len „analyt“). Napríklad by ste mohli vyskúšať sériu nealkoholických nápojov na obsah fruktózy, v takom prípade by fruktóza bola analyt.
Získa sa množstvo analytickej chemikálie vhodnej čistoty. Čistota by za normálnych okolností mala byť vyššia ako 99% a analyt by sa mal kúpiť od renomovanej spoločnosti dodávajúcej chemikálie. Napríklad v prípade fruktózy by ste si kúpili čistú fruktózu od dodávateľa chemikálie a nie od obchodu s potravinami.
Stanovte maximálnu a minimálnu predpokladanú koncentráciu analytu vo vzorkách, ktoré chcete testovať na HPLC. V prípade nealkoholických nápojov by ste preskúmali štítky nápojov a určili najnižší a najvyšší obsah fruktózy medzi nápojmi, ktoré testujete. Majte na pamäti, že počiatočná vzorka (nealkoholický nápoj) sa môže počas prípravy na analýzu riediť alebo inak manipulovať (v závislosti od použitej metódy HPLC), a tak sa môže upraviť koncentrácia analytu vo vzorkách skutočne vstreknutých do HPLC. Musí sa brať do úvahy koncentrácia analytu vo vzorkách pri HPLC.
Určte rozpúšťadlo, v ktorom budete analyzát rozpustiť, aby ste vytvorili kalibračné štandardy. Toto rozpúšťadlo musí byť schopné správne rozpustiť analyt v pomerne širokom rozmedzí koncentrácií (aspoň tak vysoké ako vo vzorkách, ktoré chcete testovať). Tiež by toto rozpúšťadlo malo byť v ideálnom prípade podobné ako "mobilná fáza:" rozpúšťadlo použité na prenos vzoriek cez prístroj HPLC.
Vypočítajte množstvo analytu potrebné na vytvorenie „zásobného štandardného“ roztoku analytu. Toto sa zistí vynásobením požadovanej koncentrácie zásobného štandardu požadovaným objemom. Koncentrácia analytu v tomto roztoku by mala byť najmenej o 10% vyššia ako najvyššia predpokladaná koncentrácia vzorky. Ak je najvyššia očakávaná koncentrácia fruktózy vo vzorke nealkoholických nápojov 8 gramov / 100 mililitrov, potom by sa zásobný štandard mohol upraviť na koncentráciu 10 gramov fruktózy / 100 mililitrov. Primeraný objem je 500 mililitrov, preto by bolo potrebných 8/100 ml x 500 ml = 40 gramov fruktózy.
Odvážte požadované množstvo analytu na vhodnú úroveň presnosti. Často je vhodná hodnota hmotnosti v gramoch s presnosťou na jedno alebo dve desatinné miesta, ale pre niektoré metódy môže byť potrebná presnosť.
Navážte odvážený analyt do odmernej banky s potrebným objemom a pridajte požadované rozpúšťadlo k značke naplnenia na banke. Použitie odmernej banky (napríklad namiesto odmernej kadičky) zvyšuje presnosť hodnoty štandardnej koncentrácie zásob. Zaistite, aby sa všetok analyt preniesol do banky; ak je to potrebné, použite na jeho umytie trochu rozpúšťadla.
Zazátkujte odmernú banku a jemne pretrepte alebo prevráťte, až kým sa analyt úplne nerozpustí.
Pripravte sériu rôznych riedení zásobného štandardu prevedením známych objemov zásobného štandardu do odmerných baniek pomocou pipiet na presný prenos a pridaním rozpúšťadla. Najnižšia štandardná koncentrácia by mala byť nižšia ako najnižšia predpokladaná vzorka, ktorá sa má analyzovať. V príklade nealkoholických nápojov, ak je najnižšia očakávaná koncentrácia fruktózy vo vzorke 2 gramy / 100 ml, potom by sa mohol pripraviť štandard 1 gram / 100 ml. To by sa dosiahlo desaťnásobným riedením štandardu pre zásoby. Série štandardov by mali obsahovať celkom 5 alebo 6 koncentrácií, takže by bolo potrebné ďalšie riedenie, aby sa získali štandardy asi 3, 5 a 8 gramov fruktózy / ml. Teraz máte sériu štandardných roztokov, pomocou ktorých môžete kalibrovať HPLC.