Obsah
Kvantifikujte svoju vzorku RNA zmeraním absorbancie ultrafialového svetla (UV). Nano-kvapkový spektrofotometer použije iba jeden alebo dva mikrolitre vzorky, ktoré môžete získať. Ostatné spektrofotometre vyžadujú oveľa väčšiu vzorku. Extinkčný koeficient pre nukleotidy pri UV vlnovej dĺžke 260 nm v 1 cm svetelnej dráhe je 20. Na základe tohto extinkčného koeficientu je absorbancia 40 ug / ml RNA za rovnakých podmienok jedna. Na základe týchto informácií môžete vypočítať koncentráciu vzorky RNA.
Ak je to potrebné, pripravte vzorku. Štandardné riedenie pre mikrokvetu je 1:40. Toto riedenie urobte pridaním 2 ul vzorky RNA do 78 ul sterilnej vody.
Postupujte podľa protokolov vášho konkrétneho spektrofotometra a kalibrujte prístroj pomocou slepého pokusu a potom stanovte optickú hustotu vzorky pri vlnovej dĺžke UV 260nm.
Vynásobte absorbanciu vzorky riediacim faktorom 40 μg RNA / ml. Rovnica by bola: „Koncentrácia RNA (µg / ml) = (OD260) x (zrieďovací faktor) x (40 µg RNA / ml) / (1 jednotka OD260)“ (Hofstra.edu) Napríklad: Ak ste vzorku zriedili 1:40 a vaša absorbancia bola 0,08, vynásobili by ste 0,08 x 40 x 40 = 128 µg / ml = 0,13 µg / µL
Zistite čistotu vzorky odčítaním ďalšej absorbancie pri vlnovej dĺžke 280 nm UV. Pomer OD 260 / OD 280 bude udávať, či - a na akej úrovni - je vaša vzorka kontaminovaná proteínom alebo fenolom. Výsledok 1,8 až 2,0 ukazuje na kvalitnú RNA.